领域先驱开发容易

CRISPR领域先驱David Liu开发新方法，可预测SSR的细胞脱靶活性

CRISPR/Cas这项技术自从问世以来，已经吸引了无数欢呼和掌声，在短短两三年之内，它已经成为了生物科学领域最炙手可热的研究工具。2019年4月26日，麻省理工大学David Liu团队在Nature Communications上发表题为“High-resolution specificity profiling and off-target prediction forsite-specific DNA recombinases”的文章，开发了一种快速绘制SSR特异性决定因素的方法。这种方法也可用于预测SSR的细胞脱靶活性，这是评估SSR作为潜在工具或治疗剂时的重要考虑因素。研究结果表明，Rec-seq可以为SSR的应用及其进一步发展提供信息。

为了表征相互作用，研究人员构建了14个Cre突变体，其中已知残基的Ala取代与loxP接触，纯化每个变体，并进行Rec-seq 绘制特定残基与Cre的DNA序列偏好之间的功能关系。Cre突变体和野生型Cre的Rec-seq谱的比较产生了对每个残基对整个loxP位点的DNA特异性的贡献的新见解。

结构和诱变研究表明Arg259的突变会影响半位点10位的特异性。实际上，Arg259→Ala变异显示10位富集下降（从野生型Cre的5.0倍增加到1.1倍）对于突变体而言，对左半位点的C或T以及右半位点的G或A的适度偏好。 Arg259→Ala突变体在loxP位点的几乎所有其他位置也显示出增加的偏好，在和16位具有特别高的偏好。这一观察与推测的ZFNs，TALE和Cas9一致，其中Arg259中Ala取代的结合能的丧失需要更高的其他蛋白质保真度：DNA接触以保持足够的结合以支持重组。

野生型Cre重组酶特异性谱分析

Rec-seq还有助于阐明loxP位置的特异性决定因素候选相互作用残基分布在Cre的三个区域：螺旋B，螺旋D和环之间。螺旋J和K。在潜在的相互作用残基处的Ala突变体的Rec-seq谱显示了相邻残基的不同影响。结果表明Cre在位的明显偏好是由多个弱或间接相互作用引起的，而不是由靠近这些位置的残基强烈决定。

此外，Rec-seq确定了先前未知参与指定位置的二级残留物的贡献。 Gln94的Ala取代导致6和7位的特异性降低，但其他地方的补偿性增加。 Gln90和Gln94两者的双Ala取代与Gln90→Ala单突变体类似地进行，表明DNA接触残基Gln90在确定两个残基中的DNA特异性中起主导作用。Rec-seq概要分析一起阐明了在位共同定义Cre识别的许多交互，并突出了次要和间接交互的重要作用。

Cre：loxP特异性的决定因素由Rec-seq鉴定为野生型Cre和Ala取代的Cre变体

DNA相互作用主要来自静态晶体结构。虽然结构提供了基于邻近度的可能相互作用的列表，但Rec-seq生成了有助于特异性的残基功能图。研究人员使用t-SNE算法来使用多维相似性分析来关联各个Rec-seq实验的结果。 t-SNE可视化中的实验接近度与它们在整个Rec-seq谱中的相似性有关。例如，含有Met44和Gln94的簇代表在位有助于特异性的功能相似的残基，而接近相同碱基的其他残基（Lys43，Lys86，Arg282）分别出现，与它们的不同作用一致。将野生型Cre簇的Rec-seq实验复制到图的中间;增加序列偏好的Ala取代的突变体出现在野生型分组的左侧，而偏好减少的变体出现在右侧。通过揭示和关联残留物在单核苷酸分辨率下确定整个底物位点的DNA识别中的个体作用，Rec-seq极大地增强了对SSR：DNA相互作用的理解。

作为基因组剂的位点特异性重组酶（SSR）的开发受到改变其天然DNA特异性的困难的限制。该文章描述了Rec-seq，一种以全面和无偏见的方式揭示SSR的DNA特异性决定簇和潜在的脱靶底物的方法。研究团队应用Rec-seq来表征几种天然和进化的SSR的DNA特异性决定因子，包括Cre，Cre的进化变体和其他SSR家族成员。这些酶及其突变体的Rec-seq谱分析揭示了先前未表征的SSR相互作用，包括SSR：DNA结构不明显的特异性决定簇。并且使用Rec-seq特异性谱来预测Tre和Brec1重组酶的脱靶底物，包括内源性人基因组序列，并证实它们在人细胞中重组这些脱靶序列的能力。这些发现将Rec-seq确立为一种高分辨率方法，用于快速鉴定具有单核苷酸分辨率的重组酶的DNA特异性，并为其进一步发展提供信息。

关于位点特异性重组酶

位点特异性重组酶（SSR）具有作为理想基因组因子的潜力，因为它们直接催化切割，链交换和DNA片段在确定的重组靶上的重新连接，而不依赖于双链断裂的内源性修复，这可以诱导插入缺失，易位，其他DNA重排或p53激活。 SSR催化的反应可导致靶DNA片段的直接替换，插入或缺失，其效率超过同源定向修复的效率。 SSR在多种细胞状态中具有活性，包括非分裂细胞，并且许多细胞在哺乳动物基因组上有效运作。但是，改变其DNA特异性以操纵任意目的序列仍然是它们广泛用于基因组的障碍。

关于CRISPR/Cas系统

1、医疗推广一直是百度的一条重要的收入 CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫防御系统，用来抵抗外来遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒等。同时，它为细菌提供了获得性免疫（类似于哺乳动物的二次免疫），当细菌遭受病毒入侵时，会产生相应的“记忆”。当病毒二次入侵时，CRISPR系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达，抵抗病毒的干扰。是不是觉得和真核生物中RNA干扰（RNAi）的原理很相似？正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因工具。在CRISPR/Cas系统中，CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。